在分子生物學(xué)領(lǐng)域，熒光定量PCR技術(shù)因其高靈敏度和特異性被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、病原體檢測等諸多方面。然而，氣溶膠污染是該實(shí)驗(yàn)過程中一個(gè)棘手的問題，它可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。因此，了解并采取有效的措施來避免氣溶膠污染至關(guān)重要。
一、氣溶膠污染的來源與危害
1.來源
-在加樣過程中，移液器的操作可能會產(chǎn)生微小的飛沫，這些飛沫形成氣溶膠散布在空氣中。例如，當(dāng)用移液器反復(fù)吹打含有核酸模板的溶液時(shí)，液體內(nèi)部的沖擊力會使部分液滴逸出。
-反應(yīng)管開蓋的時(shí)候，內(nèi)部的壓力變化容易導(dǎo)致樣本濺出，進(jìn)而形成氣溶膠。尤其是經(jīng)過高溫變性步驟后的管子，內(nèi)部蒸汽壓力較大，一旦打開，很容易有物質(zhì)噴出。
-離心操作也不應(yīng)忽視，如果離心管沒有密封好或者轉(zhuǎn)速過快，樣品可能泄漏并在離心機(jī)腔室內(nèi)形成氣溶膠。
2.危害
-一旦發(fā)生氣溶膠污染，污染源會在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中持續(xù)存在。后續(xù)進(jìn)行的其他
熒光定量PCR反應(yīng)，即使使用的試劑和樣本本身沒有問題，也可能因?yàn)檫@些殘留的氣溶膠中的核酸片段而被擴(kuò)增，從而出現(xiàn)假陽性信號。這會誤導(dǎo)研究人員對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷，浪費(fèi)大量的時(shí)間和精力去排查原因，甚至可能導(dǎo)致整個(gè)研究項(xiàng)目的方向錯(cuò)誤。
二、預(yù)防氣溶膠污染的措施
1.優(yōu)化實(shí)驗(yàn)環(huán)境布局
-設(shè)立專門的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)室，分為試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)和擴(kuò)增區(qū)等不同功能區(qū)域。各區(qū)之間要有明確的物理分隔，人員流動也應(yīng)遵循單向原則，即從清潔區(qū)向污染區(qū)移動，避免交叉污染。例如，先在試劑準(zhǔn)備區(qū)配制好所需的Master Mix等試劑，然后帶到樣本處理區(qū)加入樣本，然后進(jìn)入擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行反應(yīng)。
-定期對實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行清潔和消毒，特別是臺面、地面和儀器設(shè)備表面?？梢允褂米贤饩€照射、75%乙醇擦拭等方法，以去除可能存在的氣溶膠顆粒。同時(shí)，保持良好的通風(fēng)換氣系統(tǒng)，有助于稀釋和排出空氣中的污染物。
2.規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作流程
-使用合適的移液器吸頭，確保其質(zhì)量良好且安裝正確。在吸取液體時(shí)，動作要輕柔緩慢，避免劇烈吹打。對于珍貴的樣本或試劑，可以先預(yù)潤洗吸頭，減少掛壁現(xiàn)象帶來的誤差。
-開蓋前，先將反應(yīng)管短暫離心，使管壁上的液體沉到管底，這樣可以降低開蓋時(shí)液體濺出的風(fēng)險(xiǎn)。另外，盡量采用斜向開蓋的方式，讓蓋子慢慢離開管口，而不是垂直向上掀開。
-在進(jìn)行多個(gè)樣本的操作時(shí)，要按照一定的順序，并且每完成一個(gè)樣本的處理后，及時(shí)更換手套，防止將上一個(gè)樣本的氣溶膠帶到下一個(gè)樣本中。
3.加強(qiáng)設(shè)備維護(hù)管理
-定期檢查和維護(hù)PCR儀、離心機(jī)等關(guān)鍵設(shè)備的密封性能。對于離心機(jī)，要保證轉(zhuǎn)子安裝牢固，離心管放置平衡，并且在離心結(jié)束后等待一段時(shí)間再打開蓋子，以便內(nèi)部的氣溶膠有足夠的時(shí)間沉降。
-可以考慮使用帶有HEPA過濾器的設(shè)備，如生物安全柜，它能有效地過濾掉空氣中的微粒，包括可能存在的氣溶膠。在進(jìn)行一些高風(fēng)險(xiǎn)的操作，如處理大量未知樣本或者疑似感染性樣本時(shí)，應(yīng)在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。
4.合理設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)
-每次實(shí)驗(yàn)都要設(shè)置陰性對照，即除了不含模板DNA外，其他成分都相同的反應(yīng)體系。通過觀察陰性對照是否有擴(kuò)增信號，可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)是否存在氣溶膠污染的情況。如果陰性對照出現(xiàn)了預(yù)期之外的條帶，那就說明可能有污染發(fā)生，需要立即查找原因并采取措施加以解決。
-同時(shí)，熒光定量PCR還可以根據(jù)實(shí)際情況設(shè)置陽性對照和其他質(zhì)量控制措施，以確保整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程的可靠性。
